作者：孫千 本文轉載自公眾號：老千和他的朋友們。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/oLe7r8QTg6ZK8FZ09zhk_g

與干燥和濃縮的材料樣品不同，大多數生物樣品都是含水的或水合的，含有大量的水分。它們質地柔軟，由H、C、N、O、S和P等輕元素組成，且不具有導電性。因此，生物樣品的制備需要多個步驟才能獲得TEM樣品。生物樣品通常包括顆粒樣品以及細胞和組織樣品。

1、顆粒樣品

如果樣品是含有顆粒或纖維的液體溶液，可以在室溫下通過負染色法制備，或在低溫下通過快速冷凍法制備。

負染色過程如圖1所示。通常情況下，未經染色的顆粒在TEM中呈現(xiàn)為暗色圖像，這是因為顆粒散射和吸收入射電子（散射吸收對比度）。然而，含水樣品不能直接放入TEM進行成像。負染色需要使用含重金屬的化學物質來覆蓋或部分覆蓋顆粒，具體取決于樣品、支撐膜和染料的性質。在任何情況下，當樣品干燥后進行成像時，在TEM投影中，顆粒樣品區(qū)域呈現(xiàn)較亮的對比度，因為其周圍區(qū)域含有較厚的染料。因此，與常規(guī)圖像相比，這種顆粒呈現(xiàn)相反的對比度。

圖1負染色。(a)?不使用染色劑時，顆粒在TEM下呈現(xiàn)為暗色圖像；(b-e)?根據染色劑與樣品和支持膜之間的性質關系，負染色可呈現(xiàn)不同形式；(f)?樣品經負染色后的TEM圖像，其中顆粒的對比度與(a)相比呈現(xiàn)相反效果；(g)?肽納米纖維的TEM圖像，呈現(xiàn)為亮色對比度；(h)?通過快速冷凍制備的肽納米纖維的TEM圖像，由于它們被凍結在冰中，因此直接成像時呈現(xiàn)暗色對比度。

負染色可以通過以下方法進行：

1.?準備染色液。

2.?對帶有支撐膜的TEM載網進行輝光放電，以增加其親水性。

3.?使用一對自閉式鑷子夾住載網，在載網上放置1-3μL樣品溶液。用濾紙吸去多余的樣品液體。

4.?約10秒后，緩慢移液20μL染料（醋酸鈾、磷鎢酸、硅鎢酸鈉）。在向載網上移液時，用濾紙條輕輕吸取對面的染料。吸去載網上的多余液體。

5.?將載網在空氣中干燥。

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也可以在石蠟膜表面放置一滴（約100mL）染色液，在上述步驟4中，將TEM載網翻轉并使其漂浮在染色液的表面上20秒，然后取出并在空氣中干燥。

另一種負染色方法是將樣品溶液和染料按1:1比例混合，然后將混合溶液施加到載網上。

樣品也可以進行正染色，使染料與樣品形成復合物，這樣顆粒在TEM中呈現(xiàn)暗色對比度。這樣，正染色會增加樣品的電子不透明度，使樣品呈現(xiàn)更暗的顏色，而負染色的樣品相對于周圍的染料仍然保持較高的電子透明度。負染色在實驗室實踐中已經成為常規(guī)使用的方法。

圖1(g)顯示了使用2 wt.%醋酸鈾水溶液進行負染色制備的水凝膠形成肽的TEM圖像。納米纖維相對于周圍區(qū)域呈現(xiàn)較亮的對比度。作為對比，圖1(h)顯示了通過快速冷凍制備并在低溫下成像的納米纖維。這些纖維被包埋在冰中，沒有使用其他化學物質，因此呈現(xiàn)較暗的對比度。

2、細胞和組織樣品

生物細胞和組織樣品含有大量的水分。為了在高真空TEM中觀察樣品，樣品固定是最重要和最關鍵的步驟之一。通過適當的固定，細胞或組織的超微結構可以盡可能地保持接近活體樣品的狀態(tài)。樣品可以在室溫下通過化學固定進行經典制備，或在低溫下通過冷凍固定進行冷凍制備。制備TEM樣品需要多個步驟，如圖2所示。

圖2生物樣品制備的主要途徑

經典的室溫制備包括以下步驟：

1.樣品提取。用刀取出一小塊具有代表性的樣品（尺寸約為厘米級），如圖3(a)所示。

2.?固定。包括以下步驟：

a.?預固定（固定蛋白質）使用2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液。將提取的組織放在載玻片上，在樣品上滴加戊二醛溶液（圖3a）。使用兩片刀片切割樣品以減少變形（圖3b）。用鑷子將樣品轉移到裝有戊二醛溶液的玻璃瓶中（圖3c）。

b.?用磷酸鹽緩沖液清洗樣品兩到三次。

c.?后固定（固定脂質）使用1%-2%四氧化鋨磷酸鹽緩沖液。

d.?用磷酸鹽緩沖液清洗。

3.?脫水。樣品通過丙酮或乙醇系列進行脫水，步驟如下：50%乙醇（10分鐘）→70%乙醇（10分鐘）→80%乙醇（10分鐘）→90%乙醇（10分鐘）→95%乙醇（10分鐘）→100%乙醇（20分鐘）→100%乙醇（20分鐘）。

4.?置換。僅使用環(huán)氧丙烷（PO）并更換液體兩到三次（每次20分鐘）。

5.包埋。使用新配制的樹脂包埋樣品（圖3d）。將樣品放入硅膠包埋板的孔中，將樹脂倒在組織上。確保樹脂中沒有氣泡。根據所用樹脂的具體要求在適當條件下使樹脂聚合。

6.?超薄切片。

7.染色。用重金屬鹽（醋酸鈾和檸檬酸鉛溶液）進行后染色可以增強對比度。在封口膜上放一滴醋酸鈾溶液，將載網薄切面朝下漂浮在液滴上與染料反應10分鐘（圖3e）。用水輕輕沖洗。將載網在檸檬酸鉛溶液液滴上染色10分鐘，然后用水輕輕沖洗并風干。

8. TEM觀察。生物樣品通常在較低電壓（80-120 kV）下觀察以增強對比度，而在大多數情況下，生物樣品不需要高分辨率，因此可以使用較低電壓。

圖3?細胞和組織樣品制備。(a-c)?預固定并切成小塊；(d)?環(huán)氧樹脂包埋；(e)?醋酸鈾和檸檬酸鉛后染色；(f) TEM和(g) STEM單個O. danica細胞圖像。字母“P”代表細胞質膜，“V”代表液泡，“C”代表葉綠體。

圖3f（TEM）和圖3g（STEM）展示了單個金藻細胞的示例。簡而言之，液態(tài)藻類樣品首先與Trump固定液混合，然后通過0.45微米孔徑的塑料濾膜過濾，使細胞停留在濾膜表面。隨后將細胞在1%（毫克/毫升，重量體積比）四氧化鋨（溶于0.1 M HEPES緩沖液，pH 7.4）中染色約0.5小時，并通過甲醇（10%-100%）脫水。之后，將其包埋在環(huán)氧樹脂中并切成100納米厚度的切片用于TEM和STEM分析。在低倍率下可以觀察到細胞附著在濾紙上。

參考資料

Luo, Z. (2016). A practical guide to transmission electron microscopy : fundamentals (First edition). Momentum Press.

J.J. Bozzola, L.D. Russell. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. Jones and Bartlett Learning, Massachusetts, 1999

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