來源：Mowery, Joseph & Bauchan, Gary. (2018). Optimization of Rapid Microwave Processing of Botanical Samples for Transmission Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24. 1202-1203. 10.1017/S1431927618006499.
▍前言
傳統(tǒng)的TEM樣品制備，尤其是對于結構復雜的植物樣品，其漫長的處理周期（通常需要3-4天）一直是制約研究效率的瓶頸。試劑緩慢的滲透擴散速率，常常讓研究人員在等待中消耗寶貴的時間。
今天，為大家介紹一項由美國農業(yè)部農業(yè)研究局（USDA-ARS）電子與共聚焦顯微鏡部門的 Joseph Mowery 和 Gary Bauchan 研究員帶來的優(yōu)化技術，該技術利用快速微波處理，可以優(yōu)化植物樣品TEM制備的流程。
▍微波技術：加速滲透的利器
微波（MW）輻射技術并非全新概念，它通過加速試劑分子運動，極大地提高了試劑向組織內部的擴散速率，有望將整個制備流程從數(shù)天縮短至幾小時內。然而，隨著現(xiàn)代微波處理系統(tǒng)（如本研究使用的 Pelco BioWave Pro+）的不斷進步，針對特定樣品類型（尤其是植物樣品）優(yōu)化處理方案顯得尤為重要和迫切。植物樣品因其獨特的結構，往往需要額外的處理步驟，這也正是本研究的焦點所在。
▍挑戰(zhàn)與優(yōu)化：攻克植物樣品的特殊難題
研究團隊以煙草（Nicotiana tabacum）和番茄（Solanum lycopersicum）的葉片組織為模型，進行了一系列細致的優(yōu)化工作。
▶ 樣品均一性與滲透效率：
? 關鍵： 微波處理中，樣品尺寸和一致性至關重要。
? 優(yōu)化： 使用1毫米打孔器取樣，確保大小一致。
▶ 克服“漂浮”難題：
? 挑戰(zhàn)： 植物葉片含氣易漂浮，影響滲透。
? 優(yōu)化：
– 真空/常壓循環(huán)去空氣。
– 加0.2% Tween-20助沉降。
▶ 解決樹脂粘附難題：
? 挑戰(zhàn)： 蠟質角質層致樹脂粘附不良。
?優(yōu)化：脫水時加Z-6040硅烷偶聯(lián)劑增粘附。
▶ 樹脂滲透與聚合：
? 流程： 梯度脫水、過渡、樹脂滲透。
? 優(yōu)化： 采用兩步法水下微波聚合。
▍優(yōu)化后的詳細流程
| 步驟 | 時間 | 功率(W) | 真空 | 溫度(°C) |
|---|---|---|---|---|
| 固定液 / 真空 (x5-10) | 2分真空, 2分放氣 (x5-10) | 0 | 開 | 60 |
| 初級固定 | 2分開, 2分關, 2分開 | 150 | 循環(huán)1 | 60 |
| 初級固定 (強化) | 10秒開, 20秒關, 10秒開 | 650 | 開 | 60 |
| 緩沖液漂洗 | 1 分鐘 | 150 | 循環(huán) | 60 |
| 1% OsO? 后固定 | 5開, 2關, 5開, 2關, 5開 | 200 | 循環(huán) | 60 |
| 緩沖液漂洗 | 1 分鐘 | 150 | 循環(huán) | 60 |
| 4% 醋酸鈾染色 | 2分開, 2分關, 2分開 | 150 | 循環(huán) | 60 |
| 25% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分鐘 | 250 | 循環(huán) | 60 |
| 50% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分鐘 | 250 | 循環(huán) | 60 |
| 75% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分鐘 | 250 | 循環(huán) | 60 |
| 85% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分鐘 | 250 | 循環(huán) | 60 |
| 95% EtOH | 5 分鐘 | 250 | 循環(huán) | 60 |
| 100% EtOH (x3) | 5 分鐘 (x3) | 250 | 循環(huán) | 60 |
| 100% PO (x2) | 5 分鐘 (x2) | 250 | 關 | 60 |
| 25% LX-112 Resin | 20 分鐘 | 250 | 循環(huán) | 60 |
| 50% LX-112 Resin | 20 分鐘 | 250 | 循環(huán) | 60 |
| 75% LX-112 Resin | 20 分鐘 | 250 | 開 | 60 |
| 100% LX-112 Resin (x4) | 20 分鐘 (x4) | 250 | 開 | 60 |
| 聚合 Step 1 | 30 分鐘 | 250 | 關 | 60 |
| 聚合 Step 2 | 90 分鐘 | 450 | 關 | 100 |
*注：真空循環(huán)指在20英寸汞柱下每30秒開關一次真空。聚合步驟在密封的Beem膠囊中水下進行。EtOH=乙醇, PO=環(huán)氧丙烷。
▍結果與意義：更快、更好
通過應用這一系列優(yōu)化措施，研究團隊不僅顯著縮短了樣品處理時間，更重要的是：
- ?超微結構保存改善： 與傳統(tǒng)方法比有輕微改善。
- ?微波聚合優(yōu)勢： 形態(tài)保存有優(yōu)勢。
(圖1：微波處理樣品超微結構。)
PELCO BioWave Pro+ 微波快速組織處理儀介紹
